© Gérard Harten
Après avoir passé 4 ans au Cours Florent, Guillaume Gallienne intègre le Conservatoire National Supérieur d'Art Dramatique, où il fait la rencontre de Daniel Mesguich. Cette rencontre le conduit à jouer le rôle d'Arcas dans Mithridate de Jean Racine, aux côtés de Claude Mathieu. Les deux resteront proches par la suite et continueront à travailler ensemble au fil des années.
En 1998, il devient pensionnaire à la Comédie Française et participe à des productions de La Tempête de William Shakespeare et de Mère Courage et ses enfants de Bertolt Brecht. Plus tard, en 2005, il obtient le statut de sociétaire à la Comédie Française et participe à diverses productions de Molière, Tchekhov, Goldoni, Gontcharov, Alfred de Musset, Victor Hugo, Visconti et Brecht. La même année, il remporte le Molière du Meilleur Acteur dans un second rôle pour son interprétation dans Un Fil à la Patte de Georges Feydeau.
En 2006, il se produit alternativement au Tessenkai Theater de Tokyo, à l'Opéra de Paris et au Bolchoï de Moscou, mettant en scène respectivement Huis Clos de Jean-Paul Sartre, le ballet Caligula de Nicolas Le Riche et le ballet Illusions perdues d'Alexeï Ratmansky.
En 2010, il crée une pièce autobiographique, avec l'aide de son collaborateur de longue date et ami Claude Mathieu. Le one-man-show est intitulé Les Garçons et Guillaume, à table ! (Tutto sua Madre) et rencontre un succès majeur salué par la presse et le public. Il remporte le Molière de la Révélation Théâtrale la même année.
Trois ans plus tard, le succès perdure alors qu'il adapte la pièce pour le grand écran. Le film acclamé par la critique remporte 5 César, dont celui du Meilleur Acteur et du Meilleur Film. Il est nommé Chevalier de l'Ordre National du Mérite en 2010 et Officier dans l'Ordre des Arts et des Lettres en 2013.
En 2014, il revient au théâtre dans une production de Lucrèce Borgia de Victor Hugo dirigée par Denis Podalydès, et dans une production des Damnés de Luchino Visconti dirigée par Ivo Van Hove.
Au cinéma, sa performance dans Yves Saint Laurent de Jalil Lespert lui vaut une nomination aux César 2015, dans la catégorie Meilleur Acteur. L'année suivante, il joue aux côtés d'Adèle Exarchopoulos dans Éperdument de Pierre Godeau, ainsi qu'avec Guillaume Canet dans Cézanne et Moi de Danièle Thompson.
En 2017, il réalise son deuxième film, Maryline, et met en scène le ballet Cendrillon de Rossini à l'Opéra National de Paris.
L'année suivante, il participe à deux pièces de Molière : Le Malade imaginaire, mis en scène par Claude Stratz, et Le Bourgeois gentilhomme, mis en scène par Valérie Lesort et Christian Hecq. Il retrouve également Jalil Lespert pour adapter Le Dindon de Georges Feydeau au cinéma.
En 2020, il est présent dans trois films majeurs : The French Dispatch de Wes Anderson, et Kaamelott d'Alexandre Astier. Cette même année, il écrit et sert de dramaturge pour le ballet De l'amour et de la rage d'Alexei Ratmansky à l'American Ballet Theatre, puis pour le Met.
Il vient de tourner une série télévisée avec Kate Winslet appelée The Regime.
Actuellement, il joue Tartuffe mis en scène par Ivo Van Hove et travaille également sur une série intitulée La Recherche, une libre adaptation de l'œuvre de Marcel Proust, À la recherche du temps perdu.
